新型荧光蛋白与重组FLAG标签的融合表达纯化及与抗FLAG单克隆抗体M2亲和常数测定

通过微流体芯片技术与合成生物学方法合成新型荧光蛋白基因，从中筛选出5个新型荧光蛋白，集中对其中一个绿色荧光蛋白（G2）和一个红色荧光蛋白（H10）进行性质鉴定。应用亲和层析法（Ni2+-IDA)和快速蛋白液相色谱(FPLC)进行纯化，检测新型荧光蛋白的光谱学性质，质谱分析其分子量。结果显示，它们在大肠杆菌BL21均能顺利表达，快速成熟，具有成熟速率快、荧光强度强和发射波长更长的优点。以FLAG标签的原始序列DYKDDDDK（FLAG4）为模板，设计4种新FLAG标签FLAG1（DYKDYKYK）, FLAG2（DYKGGGYK）, FLAG3（DYKDYKDYK）和FLAG5（DYKDEDDK)与G2、H10融合，Western blotting分析表明抗FLAG单克隆抗体M2（AFM2）能够特异性识别G2-FLAG4、G2-FLAG5、H10-FLAG3、H10-FLAG4、H10-FLAG5五种FP-FLAG融合蛋白。采用非竞争性ELISA固相法,计算出FP-FLAG融合蛋白与单克隆抗FLAG M2抗体(AFM2)的亲和常数。AFM2与G2-FLAG4、G2-FLAG5的亲和常数分别为1.67E+11、4.65E+10，AFM2与H10-FLAG3、H10-FLAG4、H10-FLAG5的亲和常数分别为6.49E+10、1.47E+11、6.63E+10。结果表明FLAG原始序列DYKDDDDK与单抗M2之间的亲和力最高，DYKDEDDK、DYKDYKDYK次之，DYKDYKYK和DYKGGGYK不能与单抗M2特异识别。在FLAG融合蛋白的纯化应用中，运用这些FLAG标签的亲和力差异，在同一纯化体系下通过设计不同的洗提次序和洗提条件，可以达到逐步分离不同目的物的效果，且荧光蛋白本身作为一种标记物，与重组FLAG标签融合形成一个双功能融合蛋白，为今后FLAG融合蛋白的纯化与检测提供了新的思路和理论基础。