小麦-黑麦易位系材料R59硫素的cDNA克隆、原核表达及FT-IR研究

目的：克隆R59编码硫素的基因（R59-thionin），并在E.coli BL21(DE3)中表达。材料：小麦-黑麦易位系材料R59。方法：通过RT-PCR手段从R59幼苗叶片中扩增出R59-thionin基因，克隆测序。设计带有Nco I和Hind III酶切位点的特异引物，对cDNA编码区全长及信号肽缺失的片段（R59-thionin）进行PCR扩增，并与经过相同双酶切的pET-32(a)构建原核表达载体。重组质粒经限制性内切酶双酶切及DNA测序鉴定后，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达目的蛋白。进一步采用傅立叶变换红外光谱(FT-IR)手段研究包涵体的二级结构。结果：R59-thionin基因（GenBank登录号为EU912525）包含一个408 nt，可以编码136个氨基酸的开放式阅读框，其推导的蛋白与小麦、大麦、黑麦硫素的氨基酸同源性为78%～100%。双酶切及测序结果表明：目标基因已成功插入表达载体pET-32(a)。SDS-PAGE显示出含有完整的ORF的R59-thionin基因在大肠杆菌BL21(DE3)中不能成功表达，而信号肽缺失的片段R59-thionin主要以包涵体形式高效表达。FT-IR结果表明：在包涵体中除了1630cm-1处对应的聚集体特征吸收外，在1654cm-1还观察到-螺旋的结构。结论：信号肽缺失的R59-thionin基因在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式高效表达，包涵体保留部分天然二级结构。相关工作为该基因的结构和功能研究奠定了基础。